Herstellung des Semi-dry Transferpuffers

Proteintransfer mittels Semi-Dry Blotting

  1. Schneiden Sie die Transfermembran und vier Blatt Whatmann 3 MM Papier auf Gelgröße (7 x 8 cm).

  2. Äquilibrieren Sie die Membran in Transferpuffer bzw. bei der Verwendung von PVDF-Membranen zunächst für 2 Minuten in Methanol und anschließend für weitere 5 Minuten in Transferpuffer.

  3. Befeuchten Sie die vier Blatt Whatmann 3 MM Papier ebenfalls mit Transferpuffer.

  4. Entnehmen Sie das Gel der Kassette (siehe Abschnitt 2) und äquilibrieren Sie das Gel für 5 Minuten in Transferpuffer.

  5. Bauen Sie das Transfersandwich analog zum Tankblot-Sandwich auf, und platzieren Sie es im Semi-Dry-Blotter.

  6. Der Transfer erfolgt bei Raumtemperatur mit 1,5 mA/cm2 Gelfläche für ca. 1 Stunde (für Standardmarkerproteine).

Beim Transfer von unterschiedlich großen Proteinen empfiehlt sich der Einsatz eines diskontinuierlichen Blotting-Puffersystems.

 

Transferpuffer:

Anodenpuffer 1: 300 mM Tris, pH 9,5
Anodenpuffer 2: 30 mM Tris, pH 9,5
Kathodenpuffer: 40 mM 6-Aminohexan Säure, 20 % (v/v) Methanol

 

Blotting-Sandwich:

Anode (+)

  • 2 Filterpapiere angefeuchtet mit Anodenpuffer 1
  • 2 Filterpapiere angefeuchtet mit Anodenpuffer 2
  • Transfer-Membran
  • 3 Filterpapiere angefeuchtet mit Kathodenpuffer

Kathode (-)


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